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专注于生物学试剂及试剂盒领域
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产品型号：BC4250-50T/24S
更新时间：2024-04-15
厂商性质：生产厂家
访 问 量 ：743
010-50973130
产品分类
淀粉脱分支酶（DBE）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC4250
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 提取液 | 液体50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂一 | 液体15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂二 | 粉剂×2瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂三 | 液体15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂四 | 液体42 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
试剂二：临用前取1瓶加入3 mL试剂一，充分溶解后待用，用不完的试剂2-8℃保存4周；
标准品：10 mg无水*萄糖。临用前加入1 mL蒸馏水溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃可保存两周。
产品说明：
淀粉脱分支酶（starch debranching enzyme，DBE）能够专一、高效的裂解支链淀粉的α-1,6-糖苷键，对淀粉的结构起“修饰"的作用，淀粉脱分支酶在调整支链淀粉侧链的链长方面起着关键作用，淀粉分支酶和淀粉脱分支酶的平衡使得支链淀粉合成。
DBE催化支链淀粉产生还原糖，其与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质，通过测定其在540nm下吸光值变化可计算得DBE活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积（mL）为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后15000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
2、细胞或细菌：按照细胞或细菌数量（104个）︰提取液体积（mL）为500~1000︰1的比例（建议500万个细胞或细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后15000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3、液体：直接检测。（若溶液有浑浊则离心后取上清测定）
二、测定步骤
分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/mL的标准溶液备用。
| 序号 | 稀释前浓度（mg/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（mg/mL） |
| 1 | 10 | 100 | 1900 | 0.5 |
| 2 | 0.5 | 400 | 100 | 0.4 |
| 3 | 0.5 | 300 | 200 | 0.3 |
| 4 | 0.5 | 200 | 300 | 0.2 |
| 5 | 0.5 | 100 | 400 | 0.1 |
实验中每个标准管需200µL标准溶液。
取250μL样本沸水浴5min（盖紧，防止水分散失），冷却至室温后，8000g，常温离心5min，取上清备用。
操作表 (在1.5mL离心管中) ：
| 试剂名称（µL） | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
| 煮沸样本 | 200 | - | - | - |
| 样本 | - | 200 | - | - |
| 标准溶液 | - | - | 200 | - |
| 蒸馏水 | - | - | - | 200 |
| 试剂一 | 200 | - | 200 | 200 |
| 试剂二 | - | 200 | - | - |
| 混匀，37℃水浴或恒温培养箱中准确反应2 h | ||||
| 试剂三 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 试剂四 | 600 | 600 | 600 | 600 |
| 混匀，沸水浴5min（盖紧，防止水分散失），取出后立即冷却至室温，测定540nm处吸光值A，分别记为A对照管，A测定管，A标准管，A空白管。计算ΔA=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管（标准曲线、空白管只需检测1-2次）。 | ||||
注意：37℃水浴或恒温培养箱中反应2h后，离心管底部可能有沉淀，无需离心，直接进入下一步试验即可。
三、DBE活性计算
标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）。
DBE活性的计算：
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每mg蛋白每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=0.5x÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每g样本每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活（U/g质量）=x×V提取÷W÷T=0.5x÷W
（3）按细胞或细菌数量计算
酶活定义：每104个细胞每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活（U/104 cell）=x×V提取÷细胞数量（万个）÷T=0.5x÷细胞数量（万个）
（4）按液体体积计算
酶活定义：每mL样本每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活（U/mL）=x×V样÷V样÷T =0.5x
V提取：提取液体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：2h。
注意事项：
A大于1时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。
建议每次实验沸水浴后冷却时间保持一致。
实验实例：
取0.1g大米，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，然后15000g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测，取上清后再用提取液稀释10倍，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA=A测定管-A对照管=0.390-0.125=0.265，标准曲线y=2.248x-0.1896，计算x=0.202，按样本质量计算酶活得：
DBE酶活（U/g质量）=0.5x÷W×10（稀释倍数）=10.1 U/g质量。
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