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专注于生物学试剂及试剂盒领域
服务热线：18101056239
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产品型号：BC4280-50T/48S
更新时间：2024-04-15
厂商性质：生产厂家
访 问 量 ：934
010-50973130
产品分类
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纤维素（CLL）含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC4280
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 提取液一 | 液体200 mL×1瓶（自备） | 2-8℃保存 |
| 提取液二 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂一 | 粉剂×2瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂二 | 液体10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
提取液一：80%乙醇200 mL，即将160 mL无水乙醇和40 mL蒸馏水混合，自备。提供一个125 mL空瓶。
标准品：10 mg葡萄糖。临用前加入1 mL蒸馏水溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃保存两周。
工作液的配制：取一瓶试剂一中加入2.5 mL试剂二，充分混匀，如较难溶解，可充分震荡或加热搅拌；用不完的试剂可以2-8℃保存一周。
产品说明：
纤维素是由β-D-葡萄糖单元以 β-1,4-糖苷键连接而成的直链多聚体，通常与半纤维素、果胶及木质素结合在一起，是植物细胞壁的主要结构成分。以纤维素为原料的产品广泛应用于食品、造纸、塑料、电工及科研器材等领域。
纤维素在酸性条件下加热能分解成β-D-葡萄糖。在强酸作用条件下利用与蒽酮显色剂测定纤维素含量。\
技术指标：
低检出限：0.0023 mg/mL
线性范围：0.003125-0.09 mg/mL
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、B酮、浓硫酸、无水乙醇、蒸馏水和EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
细胞壁物质（CWM）的提取：
称取约0.3g（记为W1）样本，加入1mL提取液一，室温快速匀浆，90℃水浴20min，冷却至室温，6000g，25℃离心10min，弃上清。
沉淀先后用1.5mL提取液一和B酮各洗两遍（涡旋振荡2min左右，6000g，25℃离心10min，弃上清即可），沉淀即为粗细胞壁。
在粗细胞壁中加入1mL提取液二（去除淀粉）浸泡15小时，6000g，25℃离心10min，弃上清，将沉淀用蒸馏水清洗两遍（涡旋振荡2min左右，6000g，25℃离心10min，弃上清即可），之后干燥沉淀（60-100℃均可），得到细胞壁物质（CWM），称重记为W2。
纤维素的提取：
称取烘干的CWM约 5mg（记为W3），加入0.5mL蒸馏水充分匀浆，匀浆液转移至EP管中，用蒸馏水定容至0.5mL。
将定容后的匀浆液置于冰水混合物中，缓慢加入0.75mL浓硫酸，缓慢混匀，冰水浴中静置30min。8000g，4℃离心10min，取上清液，用蒸馏水稀释20倍后待测。
注意：1. 若样本或者干燥后的沉淀质地坚硬，可以先研碎再进行后续步骤
2. 在提取纤维素的过程中，首先，置于冰水浴中的EP管需要固定，不要上下左右浮动，一方面保障自身安全，另一方面防止冰水混合物进入EP管造成试验误差；再者，加入浓硫酸时，建议枪头伸入样本液面以下，缓慢加入，防止液面沸腾及样本碳化。
二、测定步骤
分光光度计预热30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。
将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为0.09、0.08、0.07、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液备用。
标准品稀释表
| 序号 | 稀释前浓度（mg/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（mg/mL） |
| 1 | 10 | 50 | 4950 | 0.1 |
| 2 | 0.1 | 450 | 50 | 0.09 |
| 3 | 0.1 | 400 | 100 | 0.08 |
| 4 | 0.1 | 350 | 150 | 0.07 |
| 5 | 0.1 | 500 | 500 | 0.05 |
| 6 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
| 7 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
| 8 | 0.0125 | 500 | 500 | 0.00625 |
实验中每个标准管需300µL标准溶液。
操作表 (在1.5mL离心管中) ：
| 试剂名称（µL） | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
| 样本 | 300 | - | - |
| 标准溶液 | - | 300 | - |
| 蒸馏水 | - | - | 300 |
| 工作液 | 70 | 70 | 70 |
| 浓硫酸 | 630 | 630 | 630 |
| 混匀，置95℃水浴10min（盖紧，防止水分散失），取出后冷却至室温，测定620nm处吸光值A，分别记为A测定管，A标准管，A空白管。计算ΔA=A测定管-A空白管，ΔA标准=A标准管-A空白管。（空白管及标准曲线均只需检测1-2次） |
三、纤维素含量计算
1、标准曲线的绘制：
根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA（y，ΔA）带入公式计算样本浓度（x，mg/mL）
2、纤维素含量的计算：
（1）按样本质量计算
纤维素（mg/g 质量）=x×V提取×20×（W2÷W3）÷W1÷1.11=22.52×x×W2÷W3÷W1
（2）按样本细胞壁物质（CWM）质量计算
纤维素（mg/g干重）=x×V提取×20÷W3÷1.11=22.52x÷W3
1.11：是此法测得葡萄糖含量换算为纤维素含量的常数，即111 µg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于100µg纤维素蒽酮试剂所显示的颜色；V提取：纤维素提取液体积，1.25mL（0.5mL蒸馏水+0.75mL浓硫酸）；20：样本稀释倍数；W1：样本质量，0.3g；W2：样本细胞壁物质（CWM）质量，g；W3，提取纤维素时称取的细胞壁物质（CWM）质量，g。
注意事项：
如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
浓硫酸具有强腐蚀性，操作时各个步骤均需特别注意：纤维素提取在加入浓硫酸时，建议枪头伸入样本液面以下，缓慢加入，以防止液体飞溅烧伤；95℃水浴结束取出后需冷却至室温再打开EP管盖，以防液体飞溅烧伤。
由于试剂二挥发性强且具有刺激性气味，建议在通风橱中进行工作液的配制。
实验实例：
取0.3g康乃馨叶片样本提取细胞壁物质（CWM）0.02g，称取烘干的CWM约 5mg（记为W3），提取纤维素，取上清液，用蒸馏水稀释20倍后进行检测，测得计算ΔA=A测定管-A空白管=0.821-0.051=0.77，标准曲线y=13.994+0.0072，计算x=0.0545，按样本质量计算得：
纤维素（mg/g 质量）=22.52×x×W2÷W3÷W1=16.3645 mg/g 质量。
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