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专注于生物学试剂及试剂盒领域
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产品型号：BC4310-50T/24S
更新时间：2024-04-16
厂商性质：生产厂家
访 问 量 ：946
010-50973130
产品分类
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蔗糖合成酶（分解方向；SS-I）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号: BC4310
规格: 50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体8 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体8 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入2.5 mL试剂一充分溶解待用，用不完的试剂建议分装后，-20℃保存，避免反复冻融；
2、 标准品：20 mg果糖，临用前加入1 mL蒸馏水溶解，配成20 mg/mL果糖溶液备用，2-8℃保存一周。
产品说明：
蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS）是植物糖代谢过程的关键酶，负责催化蔗糖分解与合成的可逆反应，其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG与果糖， 参与淀粉、纤维素和半纤维素的合成等代谢途径。
分解方向SS-I催化蔗糖和UDP生成果糖与UDPG，果糖与3,5 -二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得SS-I活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，8000g，离心10min，取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、 将20mg/mL标准液用蒸馏水稀释为5、4、3、2、1mg/mL的标准溶液备用。
3、 操作表 (在1.5mL离心管中操作) ：
试剂名称（µL） | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 20 | 20 | - | - |
标准溶液 | - | - | 20 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 20 |
试剂一 | 80 | 80 | 80 | |
试剂二 | - | 80 | - | - |
混匀，30℃水浴30 min后，95℃水浴10 min（盖紧，防止水分散失）。 | ||||
试剂三 | 100 | 100 | 100 | 100 |
混匀，沸水浴5 min（盖紧，防止水分散失），冷却至室温。 | ||||
蒸馏水 | 800 | 800 | 800 | 800 |
混匀，置于1mL玻璃比色皿中，测定540nm处吸光值A，分别记为A对照管，A测定管，A标准管，A空白管。计算ΔA=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管（标准曲线只需检测1-2次）。 | ||||
三、SS-I活性计算
1、 标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）。
2、 SS-I活性的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算
酶活定义：每mg蛋白每分钟分解蔗糖产生1µg果糖为1个酶活力单位。
SS-I酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）×103÷T = 33.33x÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每g样本每分钟分解蔗糖产生1µg果糖为1个酶活力单位。
SS-I酶活（U/g质量）=x×V提取×103÷W÷T = 33.33x÷W
V提取：提取液体积，1mL；103：单位换算系数，1mg=103µg；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：30min。
注意事项：
1. 当A或ΔA超过1时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。
2. 95℃水浴时EP管盖紧，防止水分散失，待冷却至室温后（建议每次实验后冷却时间保持一致），再进行下一步操作，避免液体飞溅烫伤以及影响试验数据。
实验实例：
1. 取0.1g黑麦草加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得A对照管=0.128，A测定管=0.667，标准曲线y=0.1981x-0.0491，A空白管=0.014，计算ΔA=A测定管-A对照管=0.667-0.128=0.539，x=(0.539+0.0491) ÷0.1981=2.9687，按样本质量计算酶活：
SS-I酶活（U/g质量）=33.33x÷W=33.33×2.9687÷0.1=989.4677 U/g质量。
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