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产品型号：BC4320-50T/24S
更新时间：2024-04-16
厂商性质：生产厂家
访 问 量 ：1196
010-50973130
产品分类
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细胞壁结合酸性转化酶（CWI）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC4320
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体35 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入25 mL试剂一，充分溶解后待用；
2、 标准品：10 mg无水*萄糖。临用前加入1 mL 蒸馏水充分溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃保存一周。
产品说明：
蔗糖转化酶（Invertase，Inv）不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖，在植物蔗糖代谢中发挥着重要作用。Inv根据最适pH，可分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI），其中AI根据亚细胞定位的差异又可分为可溶性酸性转化酶（Soluble acid Invertase，SAI）和细胞壁结合酸性转化酶（Cell wall-bound acid Invertase，CWI）。 CWI以离子键的形式结合在细胞壁上，在“库"组织韧皮部蔗糖卸载、蔗糖质外运输、植物的生长发育以及抵抗各种胁迫中起着重要作用。
CWI催化蔗糖降解产生还原糖，还原糖与3,5 –二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得CWI活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照质量（g）: 提取液一体积（mL）为1 : 5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，12000g，离心10min，弃上清，留沉淀；沉淀中加入1mL蒸馏水，充分震荡混匀，4℃，12000g，离心10min，弃上清，留沉淀；沉淀中加入1mL提取液二，充分混匀，4℃浸提15 h，4℃，12000g，离心10min，取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、 将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3mg/mL的标准溶液备用。
3、 操作表 (在2mL离心管中操作) ：
试剂名称（µL） | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 200 | 200 | - | - |
标准溶液 | - | - | 200 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 200 |
试剂一 | 800 | 800 | 800 | |
试剂二 | - | 800 | - | - |
混匀，37℃水浴30min后，95℃水浴10 min（盖紧，防止水分散失）。 | - | |||
试剂三 | 500 | 500 | 500 | 500 |
混匀，95℃水浴5 min（盖紧，防止水分散失），冷却至室温。 | ||||
混匀，取1000 µL置于1 mL玻璃比色皿中，测定540nm处吸光值A，分别记为A对照管，A测定管，A标准管，A空白管。计算ΔA=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管（标准曲线只需检测1-2次)。 | ||||
注意：如果样本在37℃反应后的95℃水浴步骤中出现沉淀，建议室温12000g，离心5min，取上清（若上清不足1000µL，可按比例缩小加样体系，如800µL上清+400µL试剂三）进行下一步操作。
三、CWI活性计算
1、 标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）。
2、 CWI活性的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算
酶活定义：37℃每mg蛋白每分钟分解蔗糖产生1µg还原糖为1个酶活力单位。
CWI酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）×103÷T = 33.33x÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：37℃每g样本每分钟分解蔗糖产生1µg还原糖为1个酶活力单位。
CWI酶活（U/g质量）= x×V提取×103÷W÷T = 33.33x÷W
V提取：提取液体积，1mL；103：单位换算系数，1mg=103µg；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。
注意事项：
1. 当A或ΔA超过1时，建议将样本用提取液二稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。
2. 95℃水浴时EP管盖紧，防止水分散失，待冷却至室温后（建议每次实验后冷却时间保持一致），再进行下一步操作，避免液体飞溅烫伤以及影响试验数据。
实验实例：
1. 取0.1g丁香叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，最后取上清后按照操作步骤操作，测A对照管=0.566，A测定管=0.903，标准曲线y=1.315x-0.2723，A空白管=0.058，计算ΔA=A测定管-A对照管=0.903-0.566=0.337，x=（0.337+0.2723）÷1.315=0.463，按样本质量计算酶活得：
CWI酶活（U/g质量）= 33.33x÷W= 33.33×0.463÷0.1=154.433 U/g质量。
相关系列产品：
BC0570/BC0575 中性转化酶（NI）活性检测试剂盒
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