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专注于生物学试剂及试剂盒领域
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产品型号：BC5370-50T/24S
更新时间：2024-04-19
厂商性质：生产厂家
访 问 量 ：934
010-50973130
产品分类
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土壤植酸酶活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC5370
规格：50T/24S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体2.5 mL×1瓶（自备） | 2-8℃保存 |
试剂二A | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二B | 液体50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 试剂一：甲苯，需自备。
2. 试剂二：临用前将试剂二B全部倒入试剂二A中，充分震荡溶解，用不完的试剂2-8℃可保存4周。
3. 试剂三：临用前加入7mL蒸馏水充分溶解，再将枪头伸入液面下缓慢加入1.89mL浓硫酸，用不完的试剂2-8℃可保存4周。
4. 试剂四：临用前加入35mL蒸馏水充分溶解，再加入50μL浓硫酸，用不完的试剂2-8℃可保存4周。
5. 工作液：临用前根据测定数量将试剂三：试剂四=1mL：5mL（约12T，可根据样本量按比例调整）的比例混匀，配制后于2-8℃可保存3天。
6. 标准品：10 μmol/mL无机磷标准液。
产品说明：
植酸酶（Phytase）又叫肌醇六磷酸酶，是一种蛋白质和糖的结合酶，植酸酶可以分解植酸产生无机磷和肌醇，极大的提高生物对养分的利用率。土壤植酸酶主要来自于土壤中的微生物，在磷素循环中起着重要作用，土壤植酸酶在土壤改良和农业可持续发展领域具有较强的应用前景。
在一定的环境条件下，土壤植酸酶可以分解植酸钠（肌醇六磷酸十二钠）产生无机磷和肌醇衍生物，在酸性条件下，无机磷和钼酸铵显色剂发生反应，产生蓝色的钼蓝物质，其在700nm有特征吸收峰，通过测定无机磷的含量，可计算出土壤植酸酶的活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵、30-50目筛、甲苯、浓硫酸、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
新鲜土样自然风干或 37℃烘箱风干，过 30~50 目筛。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至700nm，用蒸馏水调零。
2、标准溶液的稀释：将10μmol/mL无机磷标准液用蒸馏水稀释至1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125、0.039、0.02、0.01、0.005μmol/mL备用。
3、标准溶液稀释可参考下表：
序号 | 稀释前浓度（μmol/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（μmol/mL） |
1 | 10 | 200 | 1400 | 1.25 |
2 | 1.25 | 700 | 700 | 0.625 |
3 | 0.625 | 700 | 700 | 0.3125 |
4 | 0.3125 | 700 | 700 | 0.15625 |
5 | 0.15625 | 700 | 700 | 0.078125 |
6 | 0.078125 | 700 | 700 | 0.039 |
7 | 0.039 | 700 | 700 | 0.02 |
8 | 0.02 | 700 | 700 | 0.01 |
9 | 0.01 | 700 | 700 | 0.005 |
备注：实验中每个标准管需500µL标准溶液。
4、在EP管中按下表步骤加样：
试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
土样(g) | 0.05 | 0.05 | - | - |
试剂一(μL) | 35 | 35 | - | - |
振荡，用试剂一将土样浸湿（潮湿状态即可），室温放置15min | - | - | ||
试剂二(μL) | 835 | - | - | - |
混匀，37℃水浴/恒温培养24h，沸水浴10min | - | - | ||
试剂二(μL) | - | 835 | - | - |
10000g，25℃离心5min，取上清 | - | - | ||
标准液(μL) | - | - | 500 | - |
蒸馏水(μL) | - | - | - | 500 |
上清液(μL) | 500 | 500 | - | - |
工作液(μL) | 500 | 500 | 500 | 500 |
常温静置15min，于700nm处测定吸光值，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。分别计算 ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白（标准曲线和空白管只需做 1-2 次，每个测定管需设置一个对照管）。
三、土壤植酸酶活性的计算
1. 标准曲线的绘制
根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）代入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。
2. 土壤植酸酶活性计算
单位定义：37℃下每g土壤每天在反应体系释放1μmol无机磷为1个酶活力单位。
土壤植酸酶活性（U/g）= x×V反总÷W÷T=0.87x÷W
V反：反应体系总体积，0.87mL；W：土壤质量，g；T：反应时间，24h=1d。
注意事项：
1. 为防止沸水浴10min过程中水分散失，建议使用螺旋盖的离心管或用封口膜给EP管缠口。
2. 如果ΔA测定< 0.01，适当延长第一步37℃反应时间或加大样本量后，重新测定。如果ΔA测定＞1.2，建议将上清液用蒸馏水适当稀释后进行测定，注意乘以稀释倍数。
3. 结果于30min内测定完毕，尽量保证所有样本测定时间的一致性。
实验实例：
1. 取0.05g林土，按照测定步骤操作，在玻璃比色皿中测得A测定 = 1.187，A对照 = 0.776，∆A测定= 0.411，将∆A测定代入标曲公式y = 1.7046x + 0.0063，得出x= 0.2374，按样本质量计算酶活得：
土壤植酸酶活性（U/g）= 4.13U/g。
2. 取0.05g蘑菇地土壤，按照测定步骤操作，测得A测定 = 0.756，A对照 = 0.577，∆A测定= 0.179，将∆A测定代入标曲公式y = 1.7046x + 0.0063，得出x= 0.1013，按样本质量计算酶活得：
土壤植酸酶活性（U/g）= 1.763 U/g。
参考文献：
[1] Berry D F, Shang C, Zelazny L W. Measurement of phytase activity in soil using a chromophoric tethered phytic acid probe[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2009, 41(2):192-200.
[2] Marshall, Arebojie, Azeke, et al. Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum) [J]. Journal of Food Science&Technology, 2011, 48(6):724-729.
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